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豬用生物制品及相關(guān)豬源原輔材料中

  非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)方法

1  適用范圍

1.1豬用及采用豬源原輔材料制備的生物制品成品及半成品。

1.2豬源毒種。 

1.3 豬源細(xì)胞及相關(guān)制品生產(chǎn)用細(xì)胞。

1.4其他豬源原輔材料（如組織、血清、胰酶衍生物等）。

2  取樣和處理

2.1 疫苗

2.1.1  活疫苗  取至少2瓶樣品，按瓶簽注明頭份用適宜稀釋液分別稀釋成10頭份/0.2ml，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.1.2  滅活疫苗  取至少2瓶樣品，等量混合后進(jìn)行以下處理。

2.1.2.1 油佐劑滅活疫苗  取36 ml混合疫苗，加入正戊醇4.0 ml，充分振蕩混合1分鐘，2～8℃冰箱靜置不少于60分鐘，直至油相和水相分離。取水相進(jìn)行核酸提取。

2.1.2.2 水性佐劑滅活疫苗

2.1.2.2.1鋁膠佐劑滅活疫苗  取混合疫苗5.0 ml，搖勻，加入0.25 g解離劑CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入搖床（200 r/min）37℃解離1小時(shí)，5000 r/min離心10分鐘，取上清液進(jìn)行核酸提取。

2.1.2.2.2其他水性佐劑滅活疫苗  直接取混合樣品進(jìn)行核酸提取。

2.2 其他生物制品和半成品凍干類制品，按活疫苗進(jìn)行取樣和處理；液體制品及半成品，取至少2份（瓶）樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.3 豬源毒種  取至少2支毒種。凍干毒種，按凍干前體積復(fù)溶后等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提?。环莾龈啥痉N，等量混合后直接取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.4 豬源細(xì)胞  除另有規(guī)定外，取至少2瓶細(xì)胞濃度不少于10^7.0個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液進(jìn)行核酸提取。

2.5 其他豬源原輔材料

2.5.1 豬組織  每種組織，分別取樣和處理。取不少于2.0 g組織，研磨后用5倍體積滅菌PBS懸浮，70℃滅活30分鐘，4℃下以2000～3000 g離心10分鐘，取上清液進(jìn)行核酸提取。

2.5.2 豬血清  每批血清取至少2個(gè)最小包裝的樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.5.3 豬胰酶  干粉狀胰酶，取至少2份樣品，根據(jù)使用情況分別配制成不低于2.5%濃度的溶液，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提??；液體胰酶，取至少2個(gè)最小包裝的樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。

2.5.4 其他豬源衍生物  固體、液體或干粉狀豬源衍生物，可分別按組織、血清或干粉狀胰酶的方法進(jìn)行取樣和樣品處理。

3  核酸提取

3.1 試劑和器材

3.1.1 試劑  根據(jù)核酸提取方法確定，如氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、0.1 mol/l 檸檬酸鈉（含10%乙醇）、75%乙醇等。

3.1.2 儀器  核酸含量測(cè)定儀；常溫臺(tái)式離心機(jī)；旋渦振蕩器；水浴鍋；微量移液器1套（最大量程分別為10 μl、100 μl、200 μl、1000 μl）。

3.1.3 耗材  1.5 ml帶蓋離心管、無(wú)菌吸頭（0～10 μl、0～200 μl、100～1000 μl）、一次性乳膠手套。

3.2  操作程序（TRIZOL法），也可以選擇其他等效核酸提取方法提取樣品中的DNA。

3.2.1 取樣品250 μl，加入750 μl Trizol，顛倒混勻，室溫放置5分鐘。

3.2.2 加入200 μl氯仿，充分混勻，室溫放置10 分鐘，4℃下以12000 g離心15 分鐘。

3.2.3 棄去上清液，加入220 μl無(wú)水乙醇，顛倒混合，15～30℃放置2～3分鐘，2～8℃以2000 g離心5分鐘，沉淀物為DNA。

3.2.4 棄去上清液，加入含10%乙醇的0.1 mol/l 檸檬酸鈉750 μl洗滌DNA，15～30℃放置30分鐘，2～8℃以2000 g離心5分鐘。重復(fù)一次。

3.2.5 加入75%乙醇1.2 ml，重懸DNA沉淀，15～30℃放置20分鐘，4℃2000 g離心5分鐘。可重復(fù)一次，充分洗滌DNA沉淀。

3.2.6 棄去上清液，敞開(kāi)離心管管口，在空氣中干燥5～10分鐘，加入30～50 μl的無(wú)核酸酶滅菌水溶解DNA，－20℃以下保存?zhèn)溆谩?/span>

3.3  注意事項(xiàng)

3.3.1核酸提取試劑具有腐蝕和強(qiáng)變性能力，應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)，佩戴手套、口罩和護(hù)目鏡，防止液體飛濺到皮膚和眼睛。

3.3.2后續(xù)的核酸檢測(cè)敏感性很高，要防止樣品之間相互污染，最好使用帶濾芯的槍頭，且每次吸取取液體時(shí)均需更換槍頭。

3.3.3為防止核苷酸降解，應(yīng)避免核酸酶污染，使用的耗材均需無(wú)核酸酶。

3.3.4做好剩余樣品的無(wú)害化處理及操作臺(tái)面的消毒處理。剩余樣品可通過(guò)高壓滅菌或煮沸處理，也可放在1%衛(wèi)可或2%氫氧化鈉消毒液中浸泡處理，操作臺(tái)面使用1%衛(wèi)可擦拭。

3.3.5提取后的DNA樣品要用錫箔紙封存，取樣時(shí)應(yīng)用槍頭直接刺破錫箔紙取樣，防止污染。

4  檢測(cè)

下列兩種方法可任選其一。

4.1  實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法

4.1.1 試劑和器材

4.1.1.1 試劑

4.1.1.1.1 熒光定量PCR試劑  本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit為例，也可選用其他熒光定量PCR試劑。

4.1.1.1.2 擴(kuò)增引物及探針

擴(kuò)增引物：

ASF-05-Zsak-1466F（10 μmol/ L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'

ASF-05-Zsak-1528R（10 μmol/ L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'

探針ASF-05-Zsak-1486prob (10 μmol/ L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'

4.1.1.1.3  無(wú)核酸酶的滅菌水  PCR級(jí)別。

4.1.1.2  儀器  熒光定量PCR儀；微量移液器1套（最大量程分別為10 μl、100 μl、200 μl、1000 μl）。

4.1.1.3 耗材  1.5 ml帶蓋離心管、0.2 ml薄壁PCR管、熒光定量PCR 96孔板、0.1 ml熒光PCR八連管、無(wú)菌吸頭（0～10 μl、0～200 μl、100～1000 μl）、一次性乳膠手套。

4.1.2  操作程序

4.1.2.1 樣品DNA制備  按照前述方法進(jìn)行核酸提取。

4.1.2.2 反應(yīng)體系的配制  配制比樣品數(shù)量至少多4個(gè)的反應(yīng)體系，同時(shí)設(shè)置強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性對(duì)照。在強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管中分別加入含有非洲豬瘟P72基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA各3 μl，在陰性對(duì)照反應(yīng)管中加入3μl無(wú)核酸酶滅菌水。每個(gè)PCR反應(yīng)管中應(yīng)包含以下成分：

4.1.2.3  反應(yīng)程序  將所有待檢樣品和強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性對(duì)照反應(yīng)管放在熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：50℃2分鐘，95℃5分鐘，95℃15秒，58℃退火延伸1分鐘，45個(gè)循環(huán)（熒光信號(hào)收集在此階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)進(jìn)行）。

4.1.2.4  結(jié)果判定

4.1.2.4.1  閾值設(shè)定  試驗(yàn)操作結(jié)束后，確定Ct值。Ct值為每個(gè)樣品反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

4.1.2.4.2  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合以下情況，此次檢測(cè)方為有效：

陰性對(duì)照無(wú)Ct 值，且無(wú)擴(kuò)增曲線。

強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照的Ct 值應(yīng)在18～22之間，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。弱陽(yáng)性對(duì)照的Ct 值應(yīng)在33～35之間，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

4.1.2.4.3  判定

陰性：無(wú)Ct值，且未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判定為樣品中無(wú)ASFV核酸。

陽(yáng)性：Ct值≤40，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判定為樣品中存在ASFV核酸。

可疑：Ct值>40，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判定為可疑，應(yīng)重檢。重檢后，Ct值≤40且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線者判為陽(yáng)性，其他情況均判定為陰性。

4.2  普通 PCR檢測(cè)法

4.2.1  試劑和器材

4.2.1.1  試劑

4.2.1.1.1 PCR試劑  10×PCR緩沖液（含25 mmol/l  Mg²⁺），DNA擴(kuò)增酶，dNTP預(yù)混液。

4.2.1.1.2擴(kuò)增引物

primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；

primer PPA-2（10 μmol/L）：5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。

4.2.1.1.3  DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品  DL500。

4.2.1.1.4  TAE電泳緩沖液  配制方法見(jiàn)《電泳液標(biāo)準(zhǔn)配制流程》。

4.2.1.1.5  1%瓊脂糖凝膠板  在100 ml 1×TAE緩沖液中加入1g瓊脂糖，加熱融化，加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙錠，混勻，倒入水平放置的凝膠盤中，膠板厚度達(dá)5.0 mm左右。根據(jù)樣品數(shù)量選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔)，放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒(méi)膠面。

4.2.1.2 儀器  DNA擴(kuò)增儀，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，水平電泳槽，凝膠成相系統(tǒng)（或紫外透射儀），微量移液器1套。

4.2.1.3 耗材  1.5 ml帶蓋離心管、0.2 ml薄壁PCR管、無(wú)菌吸頭（0～10 μl、0～200 μl、100～1000 μl）。

4.2.2 操作程序

4.2.2.1 樣品DNA制備  按照前述方法進(jìn)行核酸提取。

4.2.2.2 反應(yīng)體系的配制  配制比樣品數(shù)量至少多3個(gè)的反應(yīng)體系，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照。在陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管中加入非洲豬瘟P72基因重組質(zhì)粒2.0 μl，在陰性對(duì)照反應(yīng)管中加入2.0 μl無(wú)核酸酶滅菌水。每個(gè)PCR反應(yīng)管中應(yīng)包含以下成分：

4.2.2.3  反應(yīng)程序  將所有待檢樣品及陽(yáng)性和陰性對(duì)照反應(yīng)管放在PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃2分鐘，94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘。4℃保存。

4.2.2.4  PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析  取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，加6×加樣緩沖液2.0 μl，混勻，用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)混合物進(jìn)行電泳分析，電壓120V，電流50 mA，電泳時(shí)間30分鐘。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，記錄檢測(cè)結(jié)果。

4.2.2.5 結(jié)果判定

4.2.2.5.1 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合以下情況，此次檢測(cè)方為有效：

陰性對(duì)照應(yīng)不出現(xiàn)257bp的特異性條帶。

陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)257bp的特異性條帶。

4.2.2.5.2 判定

陽(yáng)性：待檢樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的擴(kuò)增條帶，判定為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步確定基因型。

陰性：待檢樣品未出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的擴(kuò)增條帶，判定為非洲豬瘟病毒核酸陰性。

4.3  注意事項(xiàng)

4.3.1檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)遵循PCR實(shí)驗(yàn)分區(qū)原則，即應(yīng)區(qū)分試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)。

4.3.2應(yīng)避免在含有靶序列的區(qū)域中使用引物，防止污染靶序列。